Progressive activation of CyclinB1-Cdk1 coordinates entry to mitosis.
CyclinB1-Cdk1激酶是有丝分裂促进因子（MPF）的核心催化活性，但其在哺乳动物细胞中何时以及以何种速度激活仍不清楚。作者开发了一种特异性识别CyclinB1-Cdk1的FRET生物传感器，可在活人细胞中以高时间分辨率检测其激酶活性。该传感器由mCerulean供体、YPet受体、CyclinB1自磷酸化位点连接肽和Plk1...
AKAR2-AKAP12 fusion protein "biosenses" dynamic phosphorylation and localization of a GPCR-based scaffold.
蛋白激酶A（PKA）在几乎所有细胞信号转导中起核心作用，但其在活细胞中的时空激活动态难以直接观察。遗传编码荧光探针AKAR2可响应PKA磷酸化并产生荧光共振能量转移（FRET）信号，是PKA活性的生物传感器。AKAP12是一种支架蛋白，可锚定PKA、G蛋白偶联受体（GPCR）和膜磷脂，并催化受体再敏化与回收。本研究将AKAR2融合至...
Activation of cyclin B1-Cdk1 synchronizes events in the nucleus and the cytoplasm at mitosis.
cyclin B–Cdk1 激酶是大多数真核细胞进入有丝分裂的触发因子。在动物细胞中，cyclin B 在间期于细胞核与细胞质间穿梭，并在前期迅速富集于细胞核，促进核纤层解聚和核膜崩解（NEBD）。目前 cyclin B1 核内积累的直接触发机制尚不清楚，传统观点认为 Plk1 激酶通过磷酸化抑制其核输出。本研究利用一种特异性检测 ...
Visualization of JNK activity dynamics with a genetically encoded fluorescent biosensor.
JNK 介导的信号通路可将应激刺激和细胞因子等信号转导为凋亡、增殖、分化与炎症等功能反应。为在细胞内环境中刻画该通路的动态信息流与信号处理，作者构建了一种基因编码的荧光蛋白生物传感器 JNKAR1（JNK activity reporter），用于检测内源性 JNK 活性。该传感器基于磷酸化依赖的 FRET 变化：当 JNK 磷酸化...
Simultaneous visualization of protumorigenic Src and MT1-MMP activities with fluorescence resonance energy transfer.
Src激酶和膜型1基质金属蛋白酶（MT1-MMP）在肿瘤侵袭与转移中均起关键作用，但二者在致癌性表皮生长因子（EGF）刺激下如何时空协调尚不清楚。本研究将两对光谱不同的荧光共振能量转移（FRET）对——CFP/YFP与mOrange2/mCherry——组合，在单个活细胞中同时可视化Src和MT1-MMP活性。作者先在体外和哺乳动物...
Rho kinase inhibition rescues the endothelial cell cerebral cavernous malformation phenotype.
脑 cavernous malformation（CCM）是由 ccm1、ccm2 或 ccm3 失活突变引起的脑血管病变，可导致癫痫和卒中。本文报道，CCM1、CCM2 或 CCM3 蛋白表达缺失均使内皮细胞中 GTP 酶 RhoA 表达显著升高。利用 RhoA 特异性 FRET 生物传感器进行活细胞成像显示，CCM1、CCM2 ...
Design of fluorescent fusion protein probes.
许多荧光探针依赖荧光蛋白对之间的荧光共振能量转移（FRET）来报告细胞事件。当融合传感蛋白响应细胞事件发生构象变化时，供体与受体之间的能量转移效率随之改变，因此可通过FRET效率变化关联目标分子或细胞过程。本文介绍基于结构的计算设计策略：利用候选FRET生物传感器各结构域的三维结构，对柔性连接区进行构象采样，并预测距离因子、取向因子...
Rapid activation of Rac GTPase in living cells by force is independent of Src.
机械力对维持人体各组织器官功能至关重要，但机械力如何在细胞和分子水平转导为生化活性仍不清楚。本研究采用磁扭转细胞力学技术，通过经跨膜黏附分子整合素结合到细胞表面的磁珠，对活人气道平滑肌细胞施加局部机械应力。利用荧光共振能量转移（FRET）方法量化小GTP酶Rac的时空激活：以ECFP为供体、YPet为受体，通过二者荧光强度比反映Ra...
Stimulus-specific distinctions in spatial and temporal dynamics of stress-activated protein kinase kinase kinases revealed by a fluorescence resonance energy transfer biosensor.
应激激活蛋白激酶（SAPKs，包括 p38 和 JNK）是 MAPK 家族成员，在细胞暴露于紫外线、渗透压等环境压力时决定细胞命运。SAPKs 由 SAP2Ks 激活，SAP2Ks 又由多种 SAP3Ks 激活。传统磷酸化特异性抗体免疫印迹只能测量细胞群体中 SAP3K 的平均活性，难以揭示其细胞内动态。本文开发了一种基于荧光共振能...
Visualizing and quantifying the differential cleavages of the eukaryotic translation initiation factors eIF4GI and eIF4GII in the enterovirus-infected cell.
肠道病毒感染可显著关闭宿主蛋白合成，该过程主要由病毒 2A 蛋白酶（2Apro）切割真核翻译起始因子 eIF4GI 和 eIF4GII 介导。本研究基于荧光共振能量转移（FRET）开发了遗传编码的 FRET 生物传感器，用于在完整细胞中可视化和定量该特异性蛋白水解过程。通过稳定表达由绿色荧光蛋白 2（GFP2）和红色荧光蛋白 2（D...
Dynamic visualization of signal transduction in living cells: from second messengers to kinases.
信号转导研究因遗传编码FRET生物传感器的快速发展而发生范式转变。这类传感器利用一对适合FRET的荧光蛋白，将激酶磷酸化或第二信使浓度变化等信号事件转化为融合蛋白的构象变化，并通过供体与受体荧光强度比的变化进行实时检测。激酶活性报告器通常由激酶特异性底物、磷酸氨基酸结合域和两侧荧光蛋白组成；第二信使传感器则依赖配体结合域在结合Ca2...
Dissecting activation of the PAK1 kinase at protrusions in living cells.
p21激活激酶1（PAK1）是Cdc42和Rac1 GTP酶的关键效应子，通过调控肌动蛋白细胞骨架和黏附动态控制细胞突起与运动，其失调与人类癌症相关。本文报道了一种基于荧光共振能量转移（FRET）的PAK1构象生物传感器，用于在活细胞中直接观察PAK1激活的动态过程。该传感器由YFP、PAK1 C端片段和CFP融合组成，PAK1激活...
Signaling processes for initiating smooth muscle contraction upon neural stimulation.
本研究确定参与Ca2+/钙调蛋白（CaM）依赖性平滑肌肌球蛋白调节轻链（RLC）磷酸化的信号过程关系。作者在转基因小鼠平滑肌中表达基因编码生物传感器MLCK，实时测量神经刺激3 s的小鼠膀胱平滑肌条中[Ca2+]i、MLCK激活与张力。[Ca2+]i和激酶激活潜伏期分别为55±8 ms和65±6 ms，二者在100 ms随RLC磷酸...
Genetically encoded Förster resonance energy transfer sensors for the conformation of the Src family kinase Lck.
当前 Src 家族激酶成员 Lck 的调控模型假定激酶骨架结构紧缩与催化活性严格相关。关键调控酪氨酸 505 磷酸化后与同一分子上的 Src 同源 2 结构域相互作用，有效抑制酪氨酸激酶活性。TCR 结合后 Tyr505 去磷酸化被认为导致激酶结构展开和活性增强。由于缺乏提供构象变化时空分辨的工具，迄今无法在活细胞中研究 Lck 构...
Visualization of Src activity at different compartments of the plasma membrane by FRET imaging.
Src 是非受体酪氨酸激酶，参与细胞迁移、增殖和存活等过程，其活性受亚细胞定位精细调控。质膜并非均一，富含胆固醇、鞘磷脂和饱和脂肪酸的脂筏可作为信号平台，但 Src 在脂筏与非脂筏区室的调控机制仍不清楚，且传统去垢剂提取脂筏存在争议。为在活细胞中实时可视化局部 Src 活性，作者将基于 FRET 的 Src 生物传感器与膜靶向标签偶...
Real-time monitoring of human enterovirus (HEV)-infected cells and anti-HEV 3C protease potency by fluorescence resonance energy transfer.
本研究建立了一种基于荧光共振能量转移（FRET）的实时检测系统，用于监测人肠道病毒（HEV）感染细胞内 3C 蛋白酶活性并评价抗病毒药物效力。作者通过遗传工程使 HeLa 细胞稳定表达一种 FRET 探针，该探针由绿色荧光蛋白 2（GFP2）和红色荧光蛋白 2（DsRed2）组成，两者之间连接 EV71 3C 蛋白酶切割基序。稳定细...
Chapter 21: Quantitative fluorescence lifetime imaging in cells as a tool to design computational models of ran-regulated reaction networks.
理解细胞功能常需对复杂胞内通路进行定量描述。荧光寿命成像显微镜（FLIM）结合 Förster 共振能量转移（FRET）分子生物传感器的发展，使活细胞内生化活性的精确测量成为可能。本文讨论如何将定量活体成像与体外生化表征相结合，建立用于模拟生化网络行为的计算系统模型，并以有丝分裂纺锤体组装中 Ran GTPase 功能的计算建模为例...
Determination of hierarchical relationship of Src and Rac at subcellular locations with FRET biosensors.
基于荧光共振能量转移（FRET）的基因编码生物传感器能够以高时空分辨率在活细胞中可视化信号事件，但其灵敏度有限，限制了广泛应用。本研究将增强型青色荧光蛋白（ECFP）与黄色荧光蛋白变体 YPet 配对，构建 ECFP/YPet FRET 对。该 FRET 对可显著提高多种信号分子生物传感器的灵敏度，包括酪氨酸激酶 Src、小 GTP...
cAMP imaging of cells treated with pertussis toxin, cholera toxin, and anthrax edema toxin.
本研究利用荧光共振能量转移（FRET）生物传感器，对三种最常被研究的、可升高胞内环磷酸腺苷（cAMP）水平的细菌毒素——百日咳毒素（PT）、霍乱毒素（CT）和炭疽水肿毒素（ET）的酶活性进行荧光视频显微成像。将编码蛋白激酶A（PKA）调节亚基与催化亚基分别融合于CFP和YFP的质粒转染至三种细胞系，实时成像获得毒素作用的时间和空间分...
Regulation of chromatin binding by a conformational switch in the tail of the Ran exchange factor RCC1.
RCC1是Ran GTP酶唯一已知的鸟苷酸交换因子，在核质运输、纺锤体组装和核膜重建中发挥关键作用。RCC1通过DNA与组蛋白的双模式结合染色质，结合缺陷会导致染色体错误分离；apo-Ran可增强其染色质结合，但机制不清。本文证明RCC1 N端1–20氨基酸尾对DNA结合必不可少，却抑制组蛋白结合；apo-Ran显著促进RCC1与D...